1. Введение
В конце 2002 года в провинции Гуандун, Китай, началась вспышка необычного угрожающего жизни респираторного заболевания неизвестной этиологии. Это заболевание было обозначено как тяжелый острый респираторный синдром (SARS) и было позже определено Drosten et al. (2003), Ksiazek et al. (2003) и Rota et al. (2003), вызванный новым коронавирусом, названным SARS-CoV. После идентификации коронавируса как инфекционного агента при ОРВИ многочисленные лаборатории начали исследования этого вируса. По данным ВОЗ, у 8098 человек был диагностирован SARS, и 774 человека умерли от этого заболевания во время первоначальной вспышки 2003 года. Из-за серьезности заболевания SARS и заразной природы возбудителя, веб-сайт ВОЗ (http: // www .who.int / csr / sars / biosafety2003_12_18 / ru /) предоставил рекомендации по безопасной работе с этим коронавирусом. ВОЗ рекомендует уровень биобезопасности 3 (BSL3) в качестве соответствующего уровня сдерживания для работы с живым SARS-CoV, и существует опасение, что после случайного воздействия в лаборатории может произойти еще одна вспышка SARS. После окончания эпидемии атипичной пневмонии в июле 2003 года у лабораторных исследователей было три известных случая атипичной пневмонии из-за случайного воздействия вируса (Normile, 2004). Успешная инактивация вируса позволяет переносить материал из BSL3 в среду BSL2 и может снизить риск случайных инфекций благодаря небезопасной лабораторной практике. Вирусные запасы инактивированных клеточных культур также могут быть полезны для разработки вакцин и изучения их безопасности и иммуногенности. Мы изучили эффективность нескольких методов вирусной инактивации, включая методы, которые могут ингибировать репликацию или проникновение вируса.
2. Материалы и методы
2.1. Вирус и клетки
Мы заразили клетки почки африканской зеленой обезьяны (Vero E6) SARS-CoV (штамм Urbani), который был любезно предоставлен Drs. Л.Дж. Андерсон и Т.Г. Ксиазек из Центров по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия. Вкратце, однослойные клетки Vero E6 инфицировали путем инокуляции культур 50 мкл вируса (106,33 TCID50 на мл) в конечном объеме 5 мл модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) (Biosource International, Camarillo, CA) в колбах T150 в течение 1 часа. при 25 ° С. В колбу добавляли модифицированную по Дульбекко среду Игла, содержащую добавки (10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ / мл 1-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,5 мкг / мл фунгизона) (Biosource International) и клетки инкубировали при 37 ° С в течение 3 дней. Супернатант собирали, осветляли центрифугированием и хранили при -70 ° C в качестве вирусного запаса. Клетки Vero содержались в DMEM с добавками. Весь персонал носил механические респираторы для очистки воздуха (3 M, Сент-Пол, Миннесота) и работал с инфекционным вирусом в кабинете биобезопасности, в хранилище BSL3.
2.2. Количественное определение вирусных титров
Вирусные титры определяли в клеточных монослоях Vero на 24- и 96-луночных планшетах с использованием анализа 50% инфекционной дозы культуры ткани (TCID50). Последовательные разведения образцов вируса инкубировали при 37 ° C в течение 4 дней и затем исследовали на цитопатический эффект (CPE) в инфицированных клетках, как описано Ksiazek et al. (2003). Вкратце, вызванную SARS-CoV CPE инфицированных клеток определяли путем наблюдения округлых отделенных клеток в тесной связи друг с другом. Свидетельство инактивации определяли по отсутствию CPE в клетках Vero, что указывает на потерю инфекционности.
2,3. Обработка ультрафиолетом
Обработку ультрафиолетовым светом (УФ) проводили на 2 мл аликвотах вируса (объемная глубина = 1 см) в 24-луночных планшетах (Corning Inc., Corning, NY). Источник ультрафиолетового света (Spectronics Corporation, Westbury, NY) был помещен над пластиной на расстоянии 3 см от дна лунок, содержащих образцы вируса. На расстоянии 3 см наш источник света UVC (254 нм) излучал 4016 мкВт / см2 (где мкВт = 10–6 Дж / с), а источник света UVA (365 нм) излучал 2133 мкВт / см2, что было измерено с помощью радиометрического анализа (Spectronics Corporation). ). После воздействия источника ультрафиолетового света вирус замораживали для последующего анализа методом TCID50 с использованием CPE в качестве конечной точки.
2,4. Лечение гамма-излучением
Мы подготовили 400 мкл образцов SARS-CoV и хранили их на сухом льду во время транспортировки. Испытуемые образцы подвергались гамма-излучению (3000, 5000, 10000 и 15000 рад) от источника 60Co, тогда как контрольные образцы были защищены от воздействия. Тестовые и контрольные образцы обрабатывались и транспортировались одинаково, за исключением того, что тестовые образцы подвергались воздействию источника гамма-излучения. Образцы хранили замороженными до анализа инактивации с помощью анализа TCID50.
2.5. Термическая обработка вируса
Мы инкубировали 320 мкл аликвот вируса в 1,5 мл полипропиленовых криотрубок, используя нагревательный блок для достижения трех разных температур (56, 65 и 75 ° C). После термообработки образцы замораживали для последующего анализа с помощью анализа TCID50 с использованием CPE в качестве конечной точки.
2.6. Обработка формальдегидом и глутаральдегидом
Формальдегид (37%, Mallinckrodt Baker, Inc., Paris, KY) и глутаральдегид (8%, Sigma, Сент-Луис, Миссури) разводили 1:10 и 1:40 в стерильном PBS. Эти разбавленные альдегиды добавляли в образцы вируса для достижения конечных разведений 1: 1000 и 1: 4000 в 400 мкл. Конечные концентрации формальдегида составляли 0,037% (1: 1000) и 0,009% (1: 4000), а конечные концентрации глутаральдегида составляли 0,008% (1: 1000) и 0,002% (1: 4000). Образцы вируса и альдегида инкубировали при 4, 25 и 37 ° С в течение до 3 дней. Образцы кратко перемешивали с вихрем каждый день. Образцы хранили при -70 ° С до анализа методом TCID50.
2,7. обработка pH
Аликвоты вируса доводили до желаемого рН с использованием 5 М и 1 М HCl или 5 н. И 1 н. NaOH. Затем их разделяли на три аликвоты, инкубировали при желаемой температуре (4, 25 и 37 ° С), нейтрализовали до рН 7 и анализировали на титр вируса с использованием анализа TCID50.
2,8. Инфекция вирусной РНК и вирионов, разрушенных детергентом
Инфицированные клетки Vero получали путем инокуляции 20 мкл вируса при 106,37 TCID50 на мл SARS-CoV в конечном объеме 2 мл в колбе T25 в течение 1 часа при 25 ° C. DMEM с добавками добавляли в колбу и клетки инкубировали при 37 ° С в течение 3 дней. Монослой промывали 1Х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), клетки лизировали с добавлением 2,5 мл раствора фенола и изотиоцианата гуанидина (реагент TRIzol, Sigma), и цитоплазматическую РНК выделяли в соответствии со спецификациями производителя. Клетки Vero инокулировали 10 мкл очищенной РНК в 0,5 мл DMEM. Через час добавили DMEM с добавками. Кроме того, клетки Vero трансфицировали цитоплазматической РНК с использованием DMRIE-C (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки инкубировали при 37 ° C и наблюдали за CPE в дни 3 и 4.
Чтобы исследовать инфекционность вирионов, разрушенных детергентом, инфицированные SARS-CoV монослойные клетки Vero промывали и диссоциировали с трипсином / версеном, осаждали центрифугированием и промывали PBS. После центрифугирования осадок лизировали додецилсульфатом натрия / нонидет P-40 (SDS / NP-40; 0,1% SDS, 0,1% NP-40, в 0,1x PBS; Sigma), замораживали при -70 ° C, оттаивали, и осветлено центрифугированием. Супернатант использовали для инфицирования монослоев клеток Vero в 6-луночных планшетах, так что конечная концентрация SDS составляла 0,002 или 0,018%. Через три и четыре дня после инокуляции клетки наблюдали на наличие признаков CPE.
3. Результаты
3.1. Влияние радиации на инфекционность SARS-CoV
Ультрафиолетовый свет делится на три категории: UVA (320–400 нм), UVB (280–320 нм) и UVC (200–280 нм). UVC поглощается основаниями РНК и ДНК и может вызывать фотохимическое слияние двух соседних пиримидинов в ковалентно связанные димеры, которые затем становятся непарными основаниями (Perdiz et al., 2000). UVB может вызывать индукцию димеров пиримидина, но в 20–100 раз менее эффективно, чем UVC (Perdiz et al., 2000). UVA слабо поглощается ДНК и РНК и гораздо менее эффективно, чем UVC и UVB, индуцирует димеры пиримидина, но может вызывать дополнительное генетическое повреждение в результате образования активных форм кислорода, которые вызывают окисление оснований и разрывы цепей (Tyrrell et al. , 2001).
Чтобы исследовать потенциал инактивации UVA и UVC, запасы вируса помещали в 24-луночные планшеты для тканевых культур и подвергали воздействию УФ-облучения на льду в течение различного времени, как показано на рис. 1A. Воздействие вируса на ультрафиолетовый свет приводило к частичной инактивации через 1 мин с повышением эффективности до 6 мин (рис. 1А), что приводило к 400-кратному снижению инфекционного вируса. Дополнительной инактивации не наблюдалось с 6 до 10 мин. Через 15 мин вирус был полностью инактивирован до предела обнаружения анализа, который составляет ≤1,0 TCID50 (log10) на мл. Напротив, воздействие UVA не продемонстрировало значительного влияния на инактивацию вируса в течение 15-минутного периода. Наши данные показывают, что УФ-свет инактивировал вирус SARS на расстоянии 3 см в течение 15 мин.
Рис. 1. Влияние радиации на инфекционность SARS-CoV. (А) УФ-излучение. УФ-лампу помещали на 3 см выше дна 24-луночных планшетов, содержащих аликвоты по 2 мл. Образцы отбирали в каждый момент времени, замораживали и титровали в клетках Vero E6. Показанные результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (Б) Гамма-облучение. Аликвоты вируса (400 мкл) помещали в криопробирки на сухой лед и подвергали воздействию указанной дозы гамма-облучения. Контрольные образцы обрабатывали идентично, без облучения. Образцы титровали в клетках Vero E6 в трех экземплярах. Пунктирная линия обозначает предел обнаружения теста.
Стандартной процедурой инактивации вирусов при производстве биологических продуктов является гамма-облучение (Grieb et al., 2002). Чтобы исследовать влияние гамма-излучения на SARS-CoV, мы подвергли 400 мкл SARS-CoV гамма-излучению (3000, 5000, 10000 и 15000 рад) от источника 60Co, в то время как контрольные образцы были защищены от воздействия. Никакого влияния на вирусную инфекционность не наблюдалось в этом диапазоне воздействия гамма-излучения (рис. 1В).
3.2. Влияние термической обработки на инфекционность SARS-CoV
Тепло может инактивировать вирусы, денатурируя вторичные структуры белков, и тем самым может изменять конформацию белков вириона, участвующих в прикреплении и репликации в клетке-хозяине (Lelie et al., 1987, Schlegel et al., 2001). Чтобы проверить способность тепла инактивировать SARS-CoV, мы инкубировали вирус в 1,5 мл полипропиленовых криотрубок при трех температурах (56, 65 и 75 ° C) в течение увеличивающихся периодов времени. Мы обнаружили, что при 56 ° C большая часть вируса была инактивирована через 20 минут (Fig. 2A). Однако вирус оставался инфекционным на уровне, близком к пределу обнаружения для анализа, в течение, по меньшей мере, 60 минут, что позволяет предположить, что некоторые вирусные частицы были стабильны при 56 ° C (фиг. 2A и C). При 65 ° C большая часть вируса была инактивирована, если инкубировать дольше 4 минут (Fig. 2B). Опять же, некоторые инфекционные вирусы все еще могут быть обнаружены близко к пределу обнаружения для анализа через 20 минут при 65 ° C. В то время как вирус был не полностью инактивирован при 56 и 65 ° C даже через 60 минут, он был полностью инактивирован при 75 ° C через 45 минут (Рис. 2C). Удивительно, но и при 56, и при 65 ° С вирус был инактивирован в ранние моменты времени, но через 60 минут было обнаружено небольшое количество вируса. Одним из возможных объяснений этого результата может быть наличие и последующая диссоциация агрегатов. Взятые вместе, эти результаты показывают, что вирусная инактивация путем пастеризации может быть очень эффективной.
Рис. 2. Влияние термообработки на инфекционность SARS-CoV. Аликвоты вируса (400 мкл) инкубировали при (A, C) 56 ° C, (B, C) 65 ° C и (C) 75 ° C. Образцы отбирали в назначенное время, замораживали и титровали в клетках Vero E6 в трех экземплярах. Пунктирная линия обозначает предел обнаружения теста.
3.3. Влияние формальдегида и глутаральдегида на инфекционность SARS-CoV
Формалин (разбавленный формальдегид) использовался в течение ряда лет для инактивации вируса для использования в вакцинных продуктах, таких как широко используемая и очень эффективная вакцина против полиомиелита (Salk and Salk, 1984). Другие попытки использования инактивации формалина для создания вакцин против респираторно-синцитиального вируса (Kim et al., 1969) и вируса кори (Fulginiti et al., 1967) оказались бесполезными, так как они вызывали аберрантный иммунный ответ в результате индуцированных формалином возмущений вирусов. Инактивация формалина происходит, когда непротонированные аминогруппы аминокислот, такие как лизин, соединяются с формальдегидом с образованием гидроксиметиламина. Гидроксиметиламин соединяется с амино-, амидной, гуанидильной, фенольной или имидазольной группой аминокислот для создания меж- или внутримолекулярных метиленовых сшивок (для обзора см. Jiang and Schwendeman, 2000). Fraenkel-Conrat (1954) наблюдал спектры поглощения нескольких вирусов растений и установил, что формалин также обратимо связывается с РНК, блокируя считывание генома с помощью РНК-полимеразы. Глутаральдегид может также использоваться для инактивации вируса и используется в качестве дезинфицирующего агента медицинских инструментов, таких как эндоскопы (Tandon, 2000), и в качестве фиксатора для электронной микроскопии (McDonnell and Russell, 1999).
Мы исследовали инактивацию формалином и глутаральдегидом SARS-CoV путем инкубации образцов вируса с формалином или глутаральдегидом в двух разных разведениях (1: 1000 и 1: 4000). Каждый из разбавленных альдегидов инкубировали с вирусом при 4, 25 или 37 ° С. Оба альдегида проявляли температурную зависимость в своей способности инактивировать вирус (таблица 1). Ни формалин, ни глутаровый альдегид в разведении 1: 4000 не смогли полностью инактивировать вирус при 4 ° C даже после воздействия в течение 3 дней (таблица 1). При 25 и 37 ° С формалин инактивировал большую часть вируса, близкий к пределу обнаружения анализа, через 1 день, однако некоторые вирусы все еще оставались инфекционными на 3-й день. Однако глутаральдегид полностью инактивировал вирус к 2-му дню на 25-й день. ° С и днем 1 при 37 ° С. Это говорит о том, что инактивация формалином и глутаральдегидом вируса атипичной пневмонии может быть эффективным методом инактивации, если соблюдаются надлежащие условия.
Таблица 1. Влияние инактивации формальдегида и глутаральдегида SARS-CoV
Обработка формальдегидом зафиксировала клетки в анализе TCID50, поэтому вирус не мог быть обнаружен.
б Среднее геометрическое трех образцов ± S.D.
с Предел обнаружения для анализа TCID50 составляет ≤1,0.
3.4. Влияние изменений рН на инфекционность ОРВИ
Weismiller et al. (1990) определили, что рН 8,0 вызывает конформационные изменения в остроконечном белке коронавируса, вируса гепатита мыши (MHV), который обеспечивает слияние вириона с клеткой-хозяином. Однако Xiao et al. (2003) определили, что спайковый белок SARS-CoV опосредовал слияние с клеткой-хозяином при нейтральном pH. Эти данные позволяют предположить, что различные условия pH влияют на белки шипа коронавирусов, и активность белка шипа SARS-CoV может быть чувствительной к изменениям pH, возможно, путем изменения инфекционной природы вирусных частиц. Поэтому мы исследовали влияние различных воздействий рН на инфекционность SARS-CoV. После воздействия SARS-CoV на крайне щелочные условия с pH 12 и 14 в течение 1 часа и последующего изменения условий на нейтрализованный буферный раствор вирус был полностью инактивирован (рис. 3). Умеренные изменения условий рН от 5 до 9 оказывали незначительное влияние на титр вируса независимо от температуры. Однако сильно кислые условия pH 1 и 3 полностью инактивировали вирус при 25 и 37 ° C. При 4 ° С рН 3 не полностью инактивирует вирус. Эти данные указывают на то, что инфекционность SARS-CoV чувствительна к крайним значениям pH.
Загрузить: Загрузить полноразмерное изображение
Рис. 3. Влияние условий pH на инфекционность SARS-CoV. Аликвоты вируса (2 мл) доводили до указанных условий рН, разделяли на три образца, инкубировали при определенной температуре в течение 1 часа, нейтрализовали, замораживали и титровали. Пунктирная линия обозначает предел обнаружения теста.
3.5. Инфекция изолированной вирусной РНК и изолированных белков
Биохимические и молекулярно-биологические эксперименты могут потребовать выделения нуклеиновых кислот или белков из инфицированных вирусом клеток. Мы использовали раствор изотиоцианата фенола и гуанидина (TRIzol, Sigma) для выделения цитоплазматической РНК из клеток Vero, инфицированных SARS-CoV. После инокуляции клеток Vero выделенной РНК мы определили, что РНК SARS-CoV не могла продуцировать CPE в клетках (данные не показаны). Мы также обнаружили, что трансфекции клеток этой РНК с использованием реагента для трансфекции на основе липосом (DMRIE-C, Invitrogen, в соответствии с инструкциями производителя по трансфекции РНК) также недостаточно для заражения клеток Vero (данные не показаны).
Кроме того, мы проверили эффективность лечения SDS / NP-40 при инактивации SARS-CoV. Вкратце, инфицированные SARS-CoV клетки Vero лизировали раствором SDS / NP-40, осветляли центрифугированием и супернатант использовали для инфицирования монослоев клеток Vero. Через 3 и 4 дня в клетках не наблюдалось CPE, что указывает на то, что вызванное SDS / NP-40 разрушение вирионов было достаточным для предотвращения выживания инфекционных частиц.
4. Дискуссия
Инактивация SARS-CoV может быть достигнута с помощью ряда методов, при условии достаточного времени и соответствующих температурных условий. Мы предупреждаем, что процедуры инактивации, обсужденные выше, были выполнены при определенных условиях. В связи с серьезными последствиями потенциальной инфекции человека SARS-CoV, следует проявлять большую осторожность, чтобы гарантировать, что любые процедуры инактивации, используемые для обеспечения безопасности вируса для условий BSL2, эффективны для каждого запаса вируса.
Мы определили, что более 15 минут обработки UVC инактивировали вирус, в то время как свет UVA не влиял на жизнеспособность, независимо от продолжительности воздействия. Duan et al. (2003) исследовали влияние ультрафиолетового излучения на SARS-CoV при интенсивности> 90 мкВт / см2 и расстоянии 80 см и определили, что инактивация вируса произошла через 60 минут. В нашем исследовании инактивация могла происходить более эффективно из-за большей интенсивности ультрафиолетового излучения и близости источника света.
Мы также изучили влияние гамма-излучения на SARS-CoV и не обнаружили снижения инфекционности при самой высокой дозе 15000 рад. Этот результат не был удивительным, так как Центры по контролю и профилактике заболеваний использовали гораздо более высокую дозу 2 × 106 рад для инактивации потенциальных SARS-CoV-инфицированных образцов сыворотки для исследования в лабораториях BSL2 (Ksiazek et al., 2003). Эта доза находится в том же диапазоне (3–4,5 × 106 рад), который необходим для инактивации вирусов в препаратах моноклональных антител (Grieb et al., 2002) и трансплантатах костного диафиза (Pruss et al., 2002).
Наши эксперименты показали, что термическая обработка SARS-CoV в течение 45 минут при 75 ° C приводила к инактивации вируса, в то время как 90 минут при 56 и 65 ° C требовались для инактивации вируса. Laude (1981) установил, что термическая инактивация другого коронавируса, передаваемого вируса гастроэнтерита свиней, также происходила быстрее при более высоких температурах, таких как 47 и 55 ° C, чем при более низкой температуре 31 ° C. Наши данные аналогичны выводам Duan et al. (2003), где вирусная инактивация произошла через 90, 60 и 30 минут после инкубации при 56, 65 и 75 ° C соответственно. Тепло является эффективным средством инактивации SARS-CoV, однако для запасов, содержащих вирусные агрегаты, может потребоваться более длительный период воздействия тепла.
Мы определили, что формалин и глутаровый альдегид инактивировали SARS-CoV в зависимости от температуры и времени. Хотя инкубация при 4 ° C подавляла действие этих химических веществ, при 37 ° C или комнатной температуре формалин значительно снижал инфекционность вируса в 1-й день, а глутаральдегид инактивировал SARS-CoV после инкубации в течение 1-2 дней. Поскольку глютаральдегид обычно используется для дезинфекции медицинских инструментов, особенно эндоскопов, следует позаботиться о том, чтобы проанализировать требования ко времени, температуре и концентрации, необходимые для полной инактивации SARS-CoV.
Weismiller et al. (1990) определили, что рН 8,0 вызывает конформационное изменение белка шипа коронавируса MHV, которое обеспечивает слияние вириона с клеткой-хозяином. Однако Xiao et al. (2003) определили, что спайковый белок SARS-CoV опосредовал слияние с клеткой-хозяином при нейтральном pH. Эти данные позволяют предположить, что различные условия pH влияют на белки шипа коронавирусов, и активность белка шипа SARS-CoV может быть чувствительной к изменениям pH, возможно, путем изменения инфекционной природы вирусных частиц. Мы определили, что воздействие SARS-CoV в экстремальных основных или кислых условиях вызывало инактивацию, в то время как вирус оставался стабильным в диапазоне нейтральных значений pH. РН желудочной секреции желудка колеблется от 1,0 до 3,5, а тонкого и толстого кишечника - от 7,5 до 8,0 (Guyton and Hall, 1997). Взятые вместе, эти данные предполагают, что прием SARS-CoV, вероятно, приведет к инактивации большинства вирионов желудочной кислотой. Тем не менее, кислотные состояния желудка могут быть частично нейтрализованы особенно большой едой или приемом антацидных препаратов, и в этих условиях вирус может иметь шанс проникнуть через желудок в слегка основные состояния кишечника. Leung et al. (2003) показали поражение кишечника вирусом атипичной пневмонии, о чем свидетельствует наличие активной репликации вируса в биоптатах кишечника от пяти пациентов и выделение РНК SARS-CoV в образцах стула в течение 10 недель после появления симптомов. Эти данные в сочетании с ранее упомянутой устойчивостью вируса к умеренным условиям pH предполагают, что вирус SARS может выжить при проглатывании и возможен фекальный / оральный путь заражения.
Наши эксперименты показали, что ультрафиолетовое излучение, тепло, формалин, глутаральдегид и экстремальные значения рН способны инактивировать SARS-CoV. Однако гамма-облучение в испытанных дозах было недостаточным для инактивации вируса. Как и ожидалось, ни вирусная РНК, ни вирионы, разрушенные SDS / NP-40, не были инфекционными. Эти условия были подходящими для наших вирусных запасов, как описано, однако мы предупреждаем, что исследователи должны проверить вирусные запасы на полную инактивацию, прежде чем обращаться с вирусом на более низких уровнях безопасности. Эти данные анализируют образцы вируса в среде для тканевых культур, и в настоящее время мы тестируем свойства инактивации, необходимые для SARS-CoV в биологических жидкостях организма. Понимание путей, которыми SARS-CoV может быть инактивирован, позволит перенести вирус из BSL3 в условия BSL2 и будет способствовать изучению инактивированных вирусных вакцин.
