Главный
Появление SARS-CoV ознаменовало новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и огромным экономическим последствиям3,4. С тех пор несколько штаммов, в том числе штаммы гриппа A H5N1, H1N1 и H7N9 и MERS-CoV, появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов5. Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку SARS-CoV4, недавние исследования метагеномики выявили последовательности близкородственных SARS-подобных вирусов, циркулирующих в популяциях китайских летучих мышей, которые могут представлять будущую угрозу1,6. Однако одни только данные о последовательностях обеспечивают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал появления (то есть возможность заражать людей) циркулирующих CoV летучих мышей, мы создали химерный вирус, кодирующий новый, зоонозный белок-шип CoV - из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей1 - в контексте SARS-CoV, адаптированных к мышам, основной цепи. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового белка шипа вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном скелете. Используя этот подход, мы охарактеризовали CoV-инфекцию, опосредованную пиковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунных терапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе эта стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.
Последовательности SHC014 и родственных RsWIV1-CoV показывают, что эти CoVs являются ближайшими родственниками эпидемическим штаммам SARS-CoV (Fig. 1a, b); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяев: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ссылка 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2 (дополнительная рис. 1a, b и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается как экспериментами с псевдотипированием, в которых измерялась способность лентивирусов, кодирующих спайк-белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие ACE2 человека (дополнительная фигура 1), так и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (ссылка 1). Напротив, 7 из 14 остатков взаимодействия ACE2 в SHC014 отличаются от остатков в SARS-CoV, включая все пять остатков, критических для диапазона хозяев (дополнительная рис. 1c и дополнительная таблица 1). Эти изменения в сочетании с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих пик SHC014, проникать в клетки (дополнительный рисунок 1d), позволяют предположить, что пик SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Тем не менее, аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV, как сообщалось, позволили связать ACE27,8, предполагая, что для проверки требуется дополнительное функциональное тестирование. Таким образом, мы синтезировали шип SHC014 в контексте компетентного к репликации адаптированного к мышам SARS-CoV остова (далее мы будем называть химерный CoV как SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность патогенеза и исследования вакцины на мышах (дополнительная фиг.8). 2а). Несмотря на предсказания как из структурного моделирования, так и из экспериментов с псевдотипированием, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero (дополнительная фиг. 2b). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологов ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительная фиг. 2c, d). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителия дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ссылка 9) к инфекции и обнаружили надежную репликацию SHC014-MA15, сравнимую с таковой у SARS-CoV Urbani (рис. 1в). Чтобы расширить эти результаты, первичные эпителиальные культуры дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали устойчивую репликацию обоих вирусов (Fig. 1d). Вместе данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 инфицировать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.
Фигура 1: SARS-подобные вирусы реплицируются в клетках дыхательных путей человека и вызывают патогенез in vivo.
(a) Полноменные последовательности генома репрезентативных CoV были выровнены и филогенетически картированы, как описано в Online Methods. Масштабная линейка представляет нуклеотидные замены, причем только поддержка бутстрапа выше 70% помечена. Дерево показывает CoV, разделенные на три отдельные филогенетические группы, определяемые как α-CoV, β-CoV и γ-CoV. Классические кластеры подгрупп отмечены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoV и как 1a и 1b для α-CoV. (b) Аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-CoV группы 2b, включая SARS-CoV, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала представляет аминокислотные замены. (c, d) Вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) и SHC014-MA15 (зеленый) после инфицирования клеток Calu-3 2B4 (c) или хорошо дифференцированных первичных воздушно-жидкостных интерфейсных клеточных культур HAE (d) при множественность инфекции (MOI) 0,01 для обоих типов клеток. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторностями (n = 3) для экспериментов Calu-3 и HAE. (e, f) Потеря веса (n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) (e) и репликация вируса в легких (n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014- MA15) (f) 10-недельных мышей BALB / c, инфицированных 1 × 104 БОЕ адаптированного для мыши SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (то есть) маршрут. (g, h) Представлены репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N, у мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 (n = 3 мыши) (g) или SHC014-MA15 (n = 4 мыши) (h). Для каждого графика центральное значение представляет среднее по группе, а столбцы ошибок определяют s.e.m. Шкала баров, 1 мм.
Чтобы оценить роль шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB / c 104 бляшкообразующими единицами (pfu) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e-h) , Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность через 4 дня после заражения (d.p.i.); в отличие от этого, инфекция SHC014-MA15 приводила к значительной потере веса (10%), но без летальности у мышей (Fig. 1e). Изучение репликации вируса выявило почти эквивалентные титры вируса в легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). Принимая во внимание, что легкие от мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в паренхиме легких 2 d.p.i. (Fig. 1g), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигена дыхательных путей (Fig. 1h); напротив, в паренхиме или в общем гистологическом балансе не наблюдалось дефицита окрашивания антигена, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 (дополнительная таблица 2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, старых (12-месячных) животных. Животные, инфицированные SARS-MA15, быстро теряли вес и умирали от инфекции (дополнительная рис. 3а, б). Инфекция SHC014-MA15 вызывала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и картинах окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор, на основе экспериментов с мышами Ace2 - / -, у которых не наблюдалось потери веса или окрашивания антигена после инфекции SHC014-MA15 (дополнительная фиг. 4a, b и дополнительная). Таблица 2). Вместе данные указывают на то, что вирусы с шипом SHC014 способны вызывать потерю веса у мышей в контексте вирулентного остова CoV.
Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами против вируса Эбола, такой как ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител против SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на остроконечный белок SARS-CoV, и они являются вероятными реагентами для иммунотерапии11,12,13. Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженную в процентах ингибирования вирусной репликации) и обнаружили, что тогда как SARS-CoV Urbani дикого типа был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (Рис. 2a-d), Нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое с помощью фагового дисплея и избегания мутантов11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (Fig. 2a). Сходным образом, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV13, также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 (Fig. 2b, c). Для всех трех антител различия между аминокислотными последовательностями спайков SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побежавших мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), что, вероятно, объясняет отсутствие антител нейтрализующая активность против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) (рис. 2d). Вместе результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь только незначительную эффективность против возникающих SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.
Фигура 2: моноклональные антитела против SARS-CoV имеют предельную эффективность против SARS-подобных CoV.
(a – d) Нейтрализационные анализы, оценивающие эффективность (измеренную как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все первоначально были созданы против эпидемии SARS-CoV, против инфекции клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Проверенные антитела были fm6 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11,12 (а), 230,15 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 для Урбани; n = 5 для SHC014-MA15) (c) и 109,8 (n = 3 для Урбани; n = 2 для SHC014-MA15) 13 (d). Каждая точка данных представляет среднее значение группы, а столбцы ошибок определяют s.e.m. Обратите внимание, что полосы ошибок в клетках Vero, инфицированных SARS-CoV Urbani в b, c, перекрываются символами и не видны.
Изображение в полном размере
Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали старых мышей двойной инактивированной цельной SARS-CoV (DIV). Предыдущая работа показала, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от заражения гомологичным вирусом14; однако вакцина не защищала старых животных, у которых также наблюдалась патология усиленного иммунитета, что указывает на возможность нанесения вреда животным из-за вакцинации15. Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от заражения SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (дополнительная фиг. 5a, b). В соответствии с предыдущим сообщением о других гетерологичных Cobs15 группы 2b сыворотка от мышей, вакцинированных DIV, также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительная фиг. 5c). Примечательно, что вакцинация DIV привела к сильной иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительная фиг. 5d – f). Вместе эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от заражения SHC014 и может усиливать заболевание в возрасте вакцинированной группы.
В отличие от вакцинации мышей DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 104 ф.у. SHC014-MA15 и наблюдал их в течение 28 дней. Затем мы заражали мышей SARS-MA15 на 29 день (дополнительная фиг. 6a). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от заражения летальной дозой SARS-MA15, хотя был только минимальный ответ нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванный через 28 дней после инфекции SHC014-MA15 ( Дополнительный рис. 6б, 1: 200). При отсутствии вторичного усиления антигена 28 д.п. представляет ожидаемый пик титров антител и подразумевает, что со временем будет снижена защита от SARS-CoV16,17. Аналогичные результаты, демонстрирующие защиту от заражения летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у старых мышей BALB / c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительная фиг. 6c, d). Однако доза инфекции SHC014-MA15 составляет 104 п.ф. индуцировали> 10% потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (рис. 1 и дополнительная рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация более низкой дозой SHC014-MA15 (100 п.н.) не вызывает потерю веса, но она также не защищает пожилых животных от заражения SARS-MA15 смертельной дозой (дополнительная фиг. 6e, f). В совокупности данные свидетельствуют о том, что заражение SHC014-MA15 может обеспечивать перекрестную защиту от SARS-CoV посредством консервативных эпитопов, но необходимая доза вызывает патогенез и исключает использование в качестве ослабленной вакцины.
Установив, что шип SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали инфекционный клон SHC014-CoV во всю длину на основе подхода, используемого для SARS-CoV (рис. 3а) 2. Репликация в клетках Vero не выявила дефицита для SHC014-CoV относительно дефицита для SARS-CoV (Fig. 3b); однако SHC014-CoV значительно (P <0,01) ослаблялся в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис. 3c). In vivo инфекция у мышей не показала значительной потери веса, но показала снижение репликации вируса в легких при полной длине инфекции SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV Urbani (Fig. 3d, e). Вместе результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но позволяют предположить, что для его репликации требуется дополнительная адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в дыхательных клетках человека и у мышей.
Рисунок 3: Полная длина SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но ей не хватает вирулентности эпидемического SARS-CoV.
(a) Схема молекулярного клона SHC014-CoV, который был синтезирован в виде шести смежных кДНК (обозначенных SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E и SHC014F), фланкированных уникальными сайтами BglI, которые позволяли направленную сборку полноразмерной экспрессии кДНК открытые рамки считывания (для 1a, 1b, спайка, 3, конверт, матрица, 6–8 и нуклеокапсид). Подчеркнутые нуклеотиды представляют собой выступающие последовательности, образованные после расщепления рестриктазой. (b, c) Вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-CoV (зеленый) после инфицирования клеток Vero (b) или хорошо дифференцированных первичных воздух-жидкостных интерфейсных клеточных культур HAE (c) при МВД 0,01. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторностями (n = 3) для каждой группы. Данные представляют один эксперимент для клеток Vero и HAE. (d, e) Потеря веса (n = 3 для SARS-CoV MA15, n = 7 для SHC014-CoV; n = 6 для SARS-Urbani) (d) и репликация вируса в легких (n = 3 для SARS-Urbani и SHC014-CoV) (e) 10-недельных мышей BALB / c, инфицированных 1 × 105 БОЕ SARS-CoV MA15 (серый), SHC014-CoV (зеленый) или SARS-CoV Urbani (черный) через i.n. маршрут. Каждая точка данных представляет среднее значение группы, а столбцы ошибок определяют s.e.m. ** P <0,01 и *** P <0,001 с использованием двустороннего критерия Стьюдента для отдельных временных точек.
Изображение в полном размере
Во время эпидемии SARS-CoV были быстро установлены связи между цивитами пальм и штаммами CoV, которые были обнаружены у людей4. Основываясь на этом открытии, общая парадигма появления утверждает, что эпидемия SARS-CoV возникла как вирус летучей мыши, перешла к циветам и включила изменения в рецептор-связывающий домен (RBD) для улучшения связывания с циветой Ace2 (ссылка 18). Последующее воздействие на людей на рынках живых животных позволило человеку заразиться штаммом циветты, который, в свою очередь, стал эпидемическим штаммом (рис. 4а). Тем не менее, филогенетический анализ показывает, что ранние человеческие штаммы SARS более тесно связаны со штаммами летучих мышей, чем со штаммами циветты18. Поэтому вторая парадигма утверждает, что прямая передача от летучей мыши-человека инициировала появление SARS-CoV и что пальмовые циветы служили вторичным хозяином и резервуаром для продолжающейся инфекции (Fig. 4b) 19. Для обеих парадигм адаптация шипа у вторичного хозяина рассматривается как необходимость, при этом ожидается, что большинство мутаций произойдет в RBD, что будет способствовать улучшению инфекции. Обе теории предполагают, что пулы летучих мышей с летучими мышами ограничены, и что мутации в диапазоне хозяев являются как случайными, так и редкими, что снижает вероятность будущих событий появления у людей.
Рисунок 4: Парадигмы появления коронавирусов.
Штаммы коронавируса содержатся в квазивидовых пулах, циркулирующих в популяциях летучих мышей. (a, b) Традиционные теории появления SARS-CoV предполагают, что мутанты диапазона хозяев (красный круг) представляют случайные и редкие случаи, которые допускают заражение альтернативных хозяев. Парадигма вторичного хозяина (а) утверждает, что нечеловеческий хозяин заражен вирусом-предшественником летучей мыши и, благодаря адаптации, облегчает передачу человеку; последующая репликация у человека приводит к эпидемическому вирусному штамму. Прямая парадигма (б) предполагает, что передача происходит между летучими мышами и людьми без необходимости промежуточного хозяина; затем происходит отбор в популяции людей с близко родственными вирусами, реплицирующимися во вторичном хозяине, что позволяет продолжать вирусную персистенцию и адаптацию у обоих. (c) Данные от химерных SARS-подобных вирусов утверждают, что в квазивиде пулах содержатся многочисленные вирусы, способные заражать клетки человека без необходимости мутаций (красные кружки). Хотя для возникновения эпидемии могут потребоваться адаптации у вторичных или человеческих хозяев, если вирусы, содержащие спайк SHC014, рекомбинируют с вирулентными остовами CoV (кружки с зелеными контурами), то эпидемия может быть результатом заболевания у людей. Существующие данные поддерживают элементы всех трех парадигм.
Изображение в полном размере
Хотя наше исследование не лишает законной силы другие пути появления, оно доказывает третью парадигму, в которой циркулирующие пулы CoV летучих мышей поддерживают «сбалансированные» шиповые белки, которые способны инфицировать людей без мутаций или адаптации (Fig. 4c). Эта гипотеза иллюстрируется способностью химерного вируса, содержащего шип SHC014 в основной цепи SARS-CoV, вызывать устойчивую инфекцию как в культурах дыхательных путей человека, так и у мышей без адаптации RBD. В сочетании с наблюдением ранее выявленных патогенных остовов CoV3,20, наши результаты показывают, что исходные материалы, необходимые для SARS-подобных эмерджентных штаммов, в настоящее время циркулируют в резервуарах животных. Примечательно, что хотя SHC014-CoV полной длины, вероятно, требует дополнительной адаптации позвоночника для лечения заболеваний человека, документированные события высокочастотной рекомбинации в семьях CoV подчеркивают возможность появления в будущем и необходимость дальнейшей подготовки.
На сегодняшний день скрининг геномики популяций животных в основном использовался для выявления новых вирусов в условиях вспышек 21. Подход здесь расширяет эти наборы данных, чтобы исследовать вопросы появления вирусов и терапевтической эффективности. Мы считаем, что вирусы с шипом SHC014 представляют потенциальную угрозу из-за их способности размножаться в первичных культурах дыхательных путей человека, что является наилучшей доступной моделью для заболевания человека. Кроме того, наблюдаемый патогенез у мышей указывает на способность вирусов, содержащих SHC014, вызывать заболевание на моделях млекопитающих без адаптации к RBD. Примечательно, что дифференциальный тропизм в легких по сравнению с таковым у SARS-MA15 и ослабление полноразмерного SHC014-CoV в культурах HAE по сравнению с SARS-CoV Urbani позволяют предположить, что факторы помимо связывания с ACE2 - включая процессивность спайка, биодоступность рецептора или антагонизм иммунного ответа хозяина - может способствовать возникновению. Тем не менее, требуется дальнейшее тестирование на нечеловеческих приматах, чтобы перевести эти находки в патогенный потенциал у людей. Важно отметить, что недостаток доступных терапевтических средств определяет критическую необходимость дальнейшего изучения и разработки методов лечения. Обладая этими знаниями, можно разработать программы эпиднадзора, диагностические реагенты и эффективные методы лечения, которые защищают от появления CoV, специфичных для группы 2b, таких как SHC014, и могут применяться к другим ветвям CoV, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.
В дополнение к предложению подготовки против будущих появляющихся вирусов, этот подход должен быть рассмотрен в контексте предписанной правительством США паузы в исследованиях усиления функции (GOF) 22. На основании предыдущих моделей появления (Fig. 4a, b), создание химерных вирусов, таких как SHC014-MA15, не ожидалось, чтобы увеличить патогенность. Хотя SHC014-MA15 аттенуирован по сравнению с его SARS-CoV, адаптированным для мышей, аналогичные исследования, в которых изучалась патогенность CoV с шипом Urbani дикого типа в магистральной линии MA15, не показали потери веса у мышей и снижения репликации вируса23. Таким образом, по отношению к спайку Urbani-MA15 CoV SHC014-MA15 демонстрирует усиление патогенеза (рис. 1). На основании этих результатов группы научных обзоров могут посчитать подобные исследования созданием химерных вирусов, основанных на циркулирующих штаммах, слишком рискованными для преследования, поскольку нельзя исключать повышение патогенности в моделях млекопитающих. В сочетании с ограничениями на адаптированные к мышам штаммы и разработкой моноклональных антител с использованием побочных мутантов, исследование появления CoV и терапевтической эффективности может быть серьезно ограничено в будущем. Вместе эти данные и ограничения представляют собой перекресток исследовательских задач GOF; потенциал для подготовки к будущим вспышкам и смягчения их последствий должен быть сопоставлен с риском создания более опасных патогенных микроорганизмов. При разработке политики в будущем важно учитывать ценность данных, полученных в результате этих исследований, и то, заслуживают ли эти типы исследований химерных вирусов дальнейшее расследование в сравнении с присущими им рисками.
В целом, наш подход использовал данные метагеномики, чтобы идентифицировать потенциальную угрозу, которую представляет циркулирующая летучая мышь, похожая на SARS CoV SHC014. Из-за способности химерных вирусов SHC014 реплицироваться в культурах дыхательных путей человека, вызывать патогенез in vivo и избегать современных терапевтических средств, существует необходимость как в надзоре, так и в улучшенных терапевтических средствах против циркулирующих SARS-подобных вирусов. Наш подход также раскрывает использование данных метагеномики для прогнозирования появления вирусов и применения этих знаний при подготовке к лечению будущих возникающих вирусных инфекций.
