Satir
Готовящийся
Установлена температура гибели коронавируса
https://news.mail.ru/society/41422549/?frommail=1
В ходе эксперимента исследователи нагревали коронавирус до 60 градусов в течение часа, обнаружив, что после такого воздействия некоторые его штаммы все еще были способны размножаться. Часовой нагрев до 60 градусов является стандартным протоколом дезактивации вируса, применяемым в большинстве лабораторий, где исследуют анализы пациентов. При этом полностью дезактивировать коронавирус удалось после нагрева до 92 градусов в течение 15 минут.
Для проведения эксперимента французские ученые использовали клетки почек африканской зеленой обезьяны, зараженные штаммом коронавируса, полученным от пациента из Германии. Инфицированные клетки помещались в две пробирки — одну с чистой средой, другую — с белками животного происхождения, имитируя реальные, а не стерильные условия. После стандартной процедуры нагрева штаммы вируса в чистой среде оказались полностью дезактивированы, однако в нестерильных образцах некоторые из них сохранились.
Исследователи предположили, что стандартного протокола дезактивации может быть достаточно для дезактивации образцов с низкой вирусной нагрузкой, однако для образцов с высоким содержанием вируса этого может не хватить.
Авторы эксперимента отметили, что результаты их исследования должны поспособствовать выбору наиболее подходящего протокола дезактивации вируса для предотвращения угрозы заражения медперсонала, напрямую работающего с образцами.
Оценка отопительных и химических протоколов для инактивации SARS-CoV-2
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.11.036855v1.full
https://news.mail.ru/society/41422549/?frommail=1
В ходе эксперимента исследователи нагревали коронавирус до 60 градусов в течение часа, обнаружив, что после такого воздействия некоторые его штаммы все еще были способны размножаться. Часовой нагрев до 60 градусов является стандартным протоколом дезактивации вируса, применяемым в большинстве лабораторий, где исследуют анализы пациентов. При этом полностью дезактивировать коронавирус удалось после нагрева до 92 градусов в течение 15 минут.
Для проведения эксперимента французские ученые использовали клетки почек африканской зеленой обезьяны, зараженные штаммом коронавируса, полученным от пациента из Германии. Инфицированные клетки помещались в две пробирки — одну с чистой средой, другую — с белками животного происхождения, имитируя реальные, а не стерильные условия. После стандартной процедуры нагрева штаммы вируса в чистой среде оказались полностью дезактивированы, однако в нестерильных образцах некоторые из них сохранились.
Исследователи предположили, что стандартного протокола дезактивации может быть достаточно для дезактивации образцов с низкой вирусной нагрузкой, однако для образцов с высоким содержанием вируса этого может не хватить.
Авторы эксперимента отметили, что результаты их исследования должны поспособствовать выбору наиболее подходящего протокола дезактивации вируса для предотвращения угрозы заражения медперсонала, напрямую работающего с образцами.
Оценка отопительных и химических протоколов для инактивации SARS-CoV-2
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.11.036855v1.full
абстрактный
Клинические образцы, собранные у пациентов с COVID-19, обычно используются в лабораториях BSL-2 для диагностических целей. Мы использовали французскую норму NF-EN-14476 + A2, полученную из европейского стандарта EN-14885. Чтобы избежать риска заражения лабораторных работников, мы показали, что натрия-додецилсульфат и тритон-X100 должны быть добавлены в буферы тиоцианата лизиса гуанидиния для получения 6-log снижения инфекционного вируса. Протокол нагревания, состоящий из 92 ° С-15 мин, был более эффективным, чем 56 ° С-30 мин и 60 ° С-60 мин, для достижения 6-кратного снижения.
Вступление
Коронавирусная болезнь 19 (COVID-19), классифицированная ВОЗ как пандемия, представляет собой тяжелый острый респираторный синдром (SARS), вызываемый вирусом, обозначенным SARS-CoV-2 (1). С декабря 2019 года были предприняты меры по сокращению передачи COVID-19 от человека человеку, чтобы попытаться контролировать вспышку. Огромные усилия прилагаются все большим числом научных сотрудников, ежедневно работающих с живыми вирусами и / или инфекционными образцами, и, таким образом, в значительной степени подверженными риску заражения (2–4). Соответственно, ВОЗ ввела лабораторные руководящие принципы для снижения этого риска для диагностики и исследовательской деятельности (5). Тем не менее, лабораторные работники, обрабатывающие клинические образцы, будут по-прежнему подвергаться инфекционному SARS-CoV-2 (6). Прямая диагностика SARS-CoV-2 основана на обнаружении РНК с помощью RT-КПЦР (7). Методы экстракции нуклеиновых кислот (НК) используют буферы, рецептура которых предназначена для получения НК высокого качества. Они не предназначены в первую очередь для инактивации. Автоматическое извлечение NA обычно выполняется за пределами шкафов биологической безопасности, что требует загрузки только неинфекционных образцов. Для достижения этой цели предварительный этап инактивации в соответствующих условиях биобезопасности является абсолютным требованием. Предыдущие исследования рассматривали способность буферов лизиса, добавленных к образцам на начальном этапе экстракции NA, действовать в качестве агентов инактивации нескольких патогенных вирусов (включая коронавирусы). Однако противоречивые результаты, наблюдаемые при использовании разнородных протоколов, привели к противоречивым выводам (8–10). С другой стороны, Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) рекомендует использовать Triton X-100 и нагревать образец при 60 ° C в течение 1 часа для образцов, подозреваемых на содержание агента вирусной геморрагической лихорадки (VHF). Эта процедура была принята многими лабораториями для обработки образцов, которые могут содержать вирус Эбола. Другие исследования с SARS-CoV и MERS-CoV установили, что термическая обработка может инактивировать бета-коронавирусы (11,12). Следовательно, окончательная проверка SARS-CoV-2 все еще ожидается. Рано или поздно во время пандемии COVID-19 серологические тесты будут использоваться для диагностики и исследований серопревалентности с целью измерения проникновения инфекции SARS-CoV-2 на популяционном уровне. Выявление перенесенной инфекции будет иметь решающее значение для того, чтобы иммунные лица могли вернуться к своей профессиональной деятельности. Поскольку SARS-CoV-2 был обнаружен в крови во время инфекции (13), образцы должны быть инактивированы до проведения серологических тестов (14). В этом исследовании мы протестировали десять различных протоколов, включая три буфера для лизиса и шесть процедур тепловой инактивации супернатанта культуры SARS-CoV-2.
Материалы и методы
Буферы лизиса
Были испытаны три буфера для лизиса производства Qiagen (Хильден, Германия). Примерный состав каждого буфера предоставлен Qiagen. ATL (25-50% тиоцианат гуанидиния [GITC] и 1-10% додецилсульфат натрия [SDS]), VXL (25-50% GITC, 2,5-10% Triton-X-100) и AVL (50-70% GITC).
Клеточная линия
Клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero-E6; ATCC # CRL-1586) выращивали при 37 ° C в 5% CO2 с 1% пенициллина / стрептомицина (PS; 5000U.mL-1 и 5000μg.mL-1; Life Technologies) и дополнен 1% незаменимых аминокислот (Life Technologies) в минимальной незаменимой среде (Life Technologies) с 5% FBS.
Вирусы
Штамм SARS-CoV-2 человека 2019 года (Ref-SKU: 026V-03883) был выделен в Университете Чарите (Берлин, Германия) и получен из Европейского каталога вирусных архивов (проект EVA-GLOBAL H2020) (https: // www. european-virus-archive.com). Эксперименты проводились на установках BSL3.
SARS-CoV-2 титрование
SARS-CoV-2 сначала размножали и титровали на клетках Vero-E6. Исходный материал вируса разбавляли для заражения клеток Vero-E6 при MOI 0,001; затем клетки инкубировали при 37 ° С в течение 24-48 часов, после чего среду меняли и инкубацию продолжали в течение 24 часов; Затем супернатант собирали, осветляли вращением при 1500 × g в течение 10 минут, добавляли 25 мМ HEPES (Sigma) и делили на аликвоты. Аликвоты хранили при -80 ° С до титрования. Инфекцию вируса измеряли с использованием 50% -ной дозы инфекционности для тканевых культур (TCID50); кратко, когда клетки находились при слиянии 80%, шесть повторов были инфицированы 150 мкл десятикратных серийных разведений образца вируса и инкубировались в течение 3-5 дней при 37 ° C при 5% CO2. CPE считывали с использованием инвертированного микроскопа, и инфекционность выражали в виде TCID 50 / мл на основе формулы Карбера (15).
Анализы инактивации с буфером для лизиса (Таблица 1)
Использовалась французская норма NF EN 14476 + A2, полученная из европейского стандарта EN 14885 (16). Для имитации «грязных» условий перед инактивацией добавляли 3 г / л BSA (таблица 1). Каждый образец инкубировали в двух экземплярах с буфером для лизиса при комнатной температуре в течение 10 минут; затем буфер для лизиса отбрасывали ультрафильтрацией на колонках Vivaspin 500 (Sartorius, Göttingen, Germany), как описано (17); колонку трижды промывали 500 мкл PBS и элюировали в 20 мкл PBS; 0,1 мл инокулировали на монослой Vero-E6 (слияние 70%). Контроли включали неинокулированные клетки Vero-E6, клетки Vero-E6, инокулированные тестируемым буфером для лизиса (цитотоксичность), и клетки Vero-E6, инокулированные только SARS-CoV-2. Клетки инкубировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO2 в течение 5 дней. Показанием было присутствие CPE вместе с обнаружением РНК SARS-CoV-2 через RT-КПЦР на 5 день; в отсутствие CPE в день 5 пассировали 100 мкл супернатанта с тем же показанием через 5 дней (день 10).
Таблица 1. Протоколы проверены для оценки инактивации с использованием лизисных буферов
Анализы тепловой инактивации (Таблица 2)
400 мкл супернатанта SARS-CoV-2 (3,3 × 106 TCID 50 / мл) инкубировали в предварительно нагретом блоке сухого нагрева и сразу же тестировали для измерения копий TCID50 и РНК. Титрование вируса проводили в двух экземплярах до и после нагревания для измерения коэффициента снижения вирусной нагрузки.
Таблица 2. Протоколы проверены для оценки тепловой инактивации.
Целостность РНК SARS-CoV-2 после тепловой инактивации
Образцы, инактивированные нагреванием, экстрагировали с использованием Qiacube HT и набора для экстракции патогена Cador (оба из Qiagen). Вирусную РНК определяли количественно с помощью RT-КПЦР (qRT-PCR EXPRESS One-Step Superscript ™, ThermoFisher Scientific) (10 минут - 50 ° C, 2 мин - 95 ° C и 40 раз - 95 ° C - 3 с / 60 ° C- 30 секунд] с использованием серийных разведений сгенерированного Т7 стандарта синтетической РНК. Праймеры и зонд нацелены на ген N (Fw: GGCCGCAAATTGCACAAT; Rev: CCAATGCGCGACATTCC; зонд: FAM-CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCT-BHQ1. Расчетный предел обнаружения составляет 10 копий РНК на реакцию ,
Полученные результаты
Анализы инактивации с буфером для лизиса (Таблица 3)
Буферы VXL и ATL были способны инактивировать SARS-CoV-2 при вирусных нагрузках до 106 TCID50 / мл. Напротив, буфер AVL (GITC 50-70%) либо один, либо в присутствии абсолютного этанола или 1% Triton X100 приводил к частичной инактивации (50-75%). Кроме того, наши результаты показывают, что только GITC (буфер AVL) или GITC в смеси с абсолютным этанолом также не могут гарантировать инактивацию SARS-CoV-2, как описано ранее (10). Наконец, не было никакой разницы между чистыми и грязными (3 г / л BSA) условиями.
Таблица 3 Инактивация SARS CoV-2 с использованием буферов для лизиса с дополнительными реагентами и с / без
Анализы тепловой инактивации (Таблица 4)
Только протокол 92 ° C-15min был способен полностью инактивировать вирус (снижение> 6 Log10), тогда как два других протокола привели к явному снижению инфекционности (снижение 5 Log10), но с остаточной инфекционностью, равной или меньшей, чем 10 TCID50 / мл (Таблица 4). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями SARS-CoV и MERS-CoV (11,12). Не было никакой разницы между чистыми или грязными условиями.
Таблица 4 SARS-CoV-2 тепловая инактивация
Целостность РНК SARS-CoV-2 после тепловой инактивации
Анализ значений Ct (вместо TCID50) показал, что 56 ° C-30 минут и 60 ° C-60 минут существенно не влияли на количество обнаруживаемых копий РНК (Δ Ct <1) (Таблица 4). Напротив, 92 ° C-15 минут привели к значительному снижению количества копий РНК (Δ Ct> 5) (Таблица 4).
обсуждение
Несмотря на появление SARS и MERS CoV в прошлом, существует мало исследований по протоколам инактивации, направленных на снижение риска облучения для медицинского и лабораторного персонала (18).
Qiagen является выдающимся деятелем в области очистки нуклеиновых кислот. Большинство других производителей наборов для очистки NA используют такой же буфер для лизиса, как ATL, AVL и VXL. Способность AVL инактивировать патогенные вирусы обсуждалась (8–10), но данных для ATL и VXL нет. В общей сложности десять различных протоколов, использующих AVL, ATL и VXL отдельно или в сочетании с этанолом или Triton-X100, были изучены на SARS-CoV-2 в соответствии с французской версией европейской рекомендуемой процедуры (NF EN 14476 + A2) (16) , как ранее показано для других вирусов, таких как вирус Эбола или вирус ящура (8,10,19,20). Наши результаты согласуются с данными, полученными для вируса Заира Эболавирус (10). Они настоятельно рекомендуют, чтобы ATL или VXL были предпочтительнее AVL. Наши результаты подтверждают и расширяют недавние результаты (21).
Принимая во внимание, что низкая виремия SARS-CoV-2 наблюдается у пациентов с COVID-19 даже на острой стадии заболевания (18), протоколы 56 ° C-30 мин и 60 ° C-60 мин, обычно используемые перед серологией, кажутся достаточными для инактивации SARS-CoV-2, как рекомендовано перед серологическим анализом для других РНК-вирусов с оболочкой (22). Образцы, обработанные соответствующим образом, также будут пригодны для обнаружения вирусной РНК. Напротив, при обработке образцов дыхательных путей, обычно демонстрирующих гораздо более высокие вирусные нагрузки (23), только протокол 92 ° C-15 минут показал полную инактивацию; однако, является ли этот протокол более эффективным для инактивации, чем два других, резкое сокращение копий РНК, которые обнаруживаются после этого, исключает его использование для последующего обнаружения RT-qPCR SARS-CoV-2. В последнем случае инактивация с использованием VXL, ATL или подобного буфера для лизиса должна быть предпочтительной.
Поскольку клинические образцы, собранные у подозреваемых пациентов с COVID-19, обычно манипулируют в лабораториях BSL-2, результаты, представленные в этом исследовании, должны помочь выбрать наиболее подходящий протокол для инактивации, чтобы предотвратить воздействие на персонал лаборатории, отвечающий за прямое и косвенное обнаружение SARS-CoV-2 для диагностических целей.
Клинические образцы, собранные у пациентов с COVID-19, обычно используются в лабораториях BSL-2 для диагностических целей. Мы использовали французскую норму NF-EN-14476 + A2, полученную из европейского стандарта EN-14885. Чтобы избежать риска заражения лабораторных работников, мы показали, что натрия-додецилсульфат и тритон-X100 должны быть добавлены в буферы тиоцианата лизиса гуанидиния для получения 6-log снижения инфекционного вируса. Протокол нагревания, состоящий из 92 ° С-15 мин, был более эффективным, чем 56 ° С-30 мин и 60 ° С-60 мин, для достижения 6-кратного снижения.
Вступление
Коронавирусная болезнь 19 (COVID-19), классифицированная ВОЗ как пандемия, представляет собой тяжелый острый респираторный синдром (SARS), вызываемый вирусом, обозначенным SARS-CoV-2 (1). С декабря 2019 года были предприняты меры по сокращению передачи COVID-19 от человека человеку, чтобы попытаться контролировать вспышку. Огромные усилия прилагаются все большим числом научных сотрудников, ежедневно работающих с живыми вирусами и / или инфекционными образцами, и, таким образом, в значительной степени подверженными риску заражения (2–4). Соответственно, ВОЗ ввела лабораторные руководящие принципы для снижения этого риска для диагностики и исследовательской деятельности (5). Тем не менее, лабораторные работники, обрабатывающие клинические образцы, будут по-прежнему подвергаться инфекционному SARS-CoV-2 (6). Прямая диагностика SARS-CoV-2 основана на обнаружении РНК с помощью RT-КПЦР (7). Методы экстракции нуклеиновых кислот (НК) используют буферы, рецептура которых предназначена для получения НК высокого качества. Они не предназначены в первую очередь для инактивации. Автоматическое извлечение NA обычно выполняется за пределами шкафов биологической безопасности, что требует загрузки только неинфекционных образцов. Для достижения этой цели предварительный этап инактивации в соответствующих условиях биобезопасности является абсолютным требованием. Предыдущие исследования рассматривали способность буферов лизиса, добавленных к образцам на начальном этапе экстракции NA, действовать в качестве агентов инактивации нескольких патогенных вирусов (включая коронавирусы). Однако противоречивые результаты, наблюдаемые при использовании разнородных протоколов, привели к противоречивым выводам (8–10). С другой стороны, Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) рекомендует использовать Triton X-100 и нагревать образец при 60 ° C в течение 1 часа для образцов, подозреваемых на содержание агента вирусной геморрагической лихорадки (VHF). Эта процедура была принята многими лабораториями для обработки образцов, которые могут содержать вирус Эбола. Другие исследования с SARS-CoV и MERS-CoV установили, что термическая обработка может инактивировать бета-коронавирусы (11,12). Следовательно, окончательная проверка SARS-CoV-2 все еще ожидается. Рано или поздно во время пандемии COVID-19 серологические тесты будут использоваться для диагностики и исследований серопревалентности с целью измерения проникновения инфекции SARS-CoV-2 на популяционном уровне. Выявление перенесенной инфекции будет иметь решающее значение для того, чтобы иммунные лица могли вернуться к своей профессиональной деятельности. Поскольку SARS-CoV-2 был обнаружен в крови во время инфекции (13), образцы должны быть инактивированы до проведения серологических тестов (14). В этом исследовании мы протестировали десять различных протоколов, включая три буфера для лизиса и шесть процедур тепловой инактивации супернатанта культуры SARS-CoV-2.
Материалы и методы
Буферы лизиса
Были испытаны три буфера для лизиса производства Qiagen (Хильден, Германия). Примерный состав каждого буфера предоставлен Qiagen. ATL (25-50% тиоцианат гуанидиния [GITC] и 1-10% додецилсульфат натрия [SDS]), VXL (25-50% GITC, 2,5-10% Triton-X-100) и AVL (50-70% GITC).
Клеточная линия
Клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero-E6; ATCC # CRL-1586) выращивали при 37 ° C в 5% CO2 с 1% пенициллина / стрептомицина (PS; 5000U.mL-1 и 5000μg.mL-1; Life Technologies) и дополнен 1% незаменимых аминокислот (Life Technologies) в минимальной незаменимой среде (Life Technologies) с 5% FBS.
Вирусы
Штамм SARS-CoV-2 человека 2019 года (Ref-SKU: 026V-03883) был выделен в Университете Чарите (Берлин, Германия) и получен из Европейского каталога вирусных архивов (проект EVA-GLOBAL H2020) (https: // www. european-virus-archive.com). Эксперименты проводились на установках BSL3.
SARS-CoV-2 титрование
SARS-CoV-2 сначала размножали и титровали на клетках Vero-E6. Исходный материал вируса разбавляли для заражения клеток Vero-E6 при MOI 0,001; затем клетки инкубировали при 37 ° С в течение 24-48 часов, после чего среду меняли и инкубацию продолжали в течение 24 часов; Затем супернатант собирали, осветляли вращением при 1500 × g в течение 10 минут, добавляли 25 мМ HEPES (Sigma) и делили на аликвоты. Аликвоты хранили при -80 ° С до титрования. Инфекцию вируса измеряли с использованием 50% -ной дозы инфекционности для тканевых культур (TCID50); кратко, когда клетки находились при слиянии 80%, шесть повторов были инфицированы 150 мкл десятикратных серийных разведений образца вируса и инкубировались в течение 3-5 дней при 37 ° C при 5% CO2. CPE считывали с использованием инвертированного микроскопа, и инфекционность выражали в виде TCID 50 / мл на основе формулы Карбера (15).
Анализы инактивации с буфером для лизиса (Таблица 1)
Использовалась французская норма NF EN 14476 + A2, полученная из европейского стандарта EN 14885 (16). Для имитации «грязных» условий перед инактивацией добавляли 3 г / л BSA (таблица 1). Каждый образец инкубировали в двух экземплярах с буфером для лизиса при комнатной температуре в течение 10 минут; затем буфер для лизиса отбрасывали ультрафильтрацией на колонках Vivaspin 500 (Sartorius, Göttingen, Germany), как описано (17); колонку трижды промывали 500 мкл PBS и элюировали в 20 мкл PBS; 0,1 мл инокулировали на монослой Vero-E6 (слияние 70%). Контроли включали неинокулированные клетки Vero-E6, клетки Vero-E6, инокулированные тестируемым буфером для лизиса (цитотоксичность), и клетки Vero-E6, инокулированные только SARS-CoV-2. Клетки инкубировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO2 в течение 5 дней. Показанием было присутствие CPE вместе с обнаружением РНК SARS-CoV-2 через RT-КПЦР на 5 день; в отсутствие CPE в день 5 пассировали 100 мкл супернатанта с тем же показанием через 5 дней (день 10).
Таблица 1. Протоколы проверены для оценки инактивации с использованием лизисных буферов
Анализы тепловой инактивации (Таблица 2)
400 мкл супернатанта SARS-CoV-2 (3,3 × 106 TCID 50 / мл) инкубировали в предварительно нагретом блоке сухого нагрева и сразу же тестировали для измерения копий TCID50 и РНК. Титрование вируса проводили в двух экземплярах до и после нагревания для измерения коэффициента снижения вирусной нагрузки.
Таблица 2. Протоколы проверены для оценки тепловой инактивации.
Целостность РНК SARS-CoV-2 после тепловой инактивации
Образцы, инактивированные нагреванием, экстрагировали с использованием Qiacube HT и набора для экстракции патогена Cador (оба из Qiagen). Вирусную РНК определяли количественно с помощью RT-КПЦР (qRT-PCR EXPRESS One-Step Superscript ™, ThermoFisher Scientific) (10 минут - 50 ° C, 2 мин - 95 ° C и 40 раз - 95 ° C - 3 с / 60 ° C- 30 секунд] с использованием серийных разведений сгенерированного Т7 стандарта синтетической РНК. Праймеры и зонд нацелены на ген N (Fw: GGCCGCAAATTGCACAAT; Rev: CCAATGCGCGACATTCC; зонд: FAM-CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCT-BHQ1. Расчетный предел обнаружения составляет 10 копий РНК на реакцию ,
Полученные результаты
Анализы инактивации с буфером для лизиса (Таблица 3)
Буферы VXL и ATL были способны инактивировать SARS-CoV-2 при вирусных нагрузках до 106 TCID50 / мл. Напротив, буфер AVL (GITC 50-70%) либо один, либо в присутствии абсолютного этанола или 1% Triton X100 приводил к частичной инактивации (50-75%). Кроме того, наши результаты показывают, что только GITC (буфер AVL) или GITC в смеси с абсолютным этанолом также не могут гарантировать инактивацию SARS-CoV-2, как описано ранее (10). Наконец, не было никакой разницы между чистыми и грязными (3 г / л BSA) условиями.
Таблица 3 Инактивация SARS CoV-2 с использованием буферов для лизиса с дополнительными реагентами и с / без
Анализы тепловой инактивации (Таблица 4)
Только протокол 92 ° C-15min был способен полностью инактивировать вирус (снижение> 6 Log10), тогда как два других протокола привели к явному снижению инфекционности (снижение 5 Log10), но с остаточной инфекционностью, равной или меньшей, чем 10 TCID50 / мл (Таблица 4). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями SARS-CoV и MERS-CoV (11,12). Не было никакой разницы между чистыми или грязными условиями.
Таблица 4 SARS-CoV-2 тепловая инактивация
Целостность РНК SARS-CoV-2 после тепловой инактивации
Анализ значений Ct (вместо TCID50) показал, что 56 ° C-30 минут и 60 ° C-60 минут существенно не влияли на количество обнаруживаемых копий РНК (Δ Ct <1) (Таблица 4). Напротив, 92 ° C-15 минут привели к значительному снижению количества копий РНК (Δ Ct> 5) (Таблица 4).
обсуждение
Несмотря на появление SARS и MERS CoV в прошлом, существует мало исследований по протоколам инактивации, направленных на снижение риска облучения для медицинского и лабораторного персонала (18).
Qiagen является выдающимся деятелем в области очистки нуклеиновых кислот. Большинство других производителей наборов для очистки NA используют такой же буфер для лизиса, как ATL, AVL и VXL. Способность AVL инактивировать патогенные вирусы обсуждалась (8–10), но данных для ATL и VXL нет. В общей сложности десять различных протоколов, использующих AVL, ATL и VXL отдельно или в сочетании с этанолом или Triton-X100, были изучены на SARS-CoV-2 в соответствии с французской версией европейской рекомендуемой процедуры (NF EN 14476 + A2) (16) , как ранее показано для других вирусов, таких как вирус Эбола или вирус ящура (8,10,19,20). Наши результаты согласуются с данными, полученными для вируса Заира Эболавирус (10). Они настоятельно рекомендуют, чтобы ATL или VXL были предпочтительнее AVL. Наши результаты подтверждают и расширяют недавние результаты (21).
Принимая во внимание, что низкая виремия SARS-CoV-2 наблюдается у пациентов с COVID-19 даже на острой стадии заболевания (18), протоколы 56 ° C-30 мин и 60 ° C-60 мин, обычно используемые перед серологией, кажутся достаточными для инактивации SARS-CoV-2, как рекомендовано перед серологическим анализом для других РНК-вирусов с оболочкой (22). Образцы, обработанные соответствующим образом, также будут пригодны для обнаружения вирусной РНК. Напротив, при обработке образцов дыхательных путей, обычно демонстрирующих гораздо более высокие вирусные нагрузки (23), только протокол 92 ° C-15 минут показал полную инактивацию; однако, является ли этот протокол более эффективным для инактивации, чем два других, резкое сокращение копий РНК, которые обнаруживаются после этого, исключает его использование для последующего обнаружения RT-qPCR SARS-CoV-2. В последнем случае инактивация с использованием VXL, ATL или подобного буфера для лизиса должна быть предпочтительной.
Поскольку клинические образцы, собранные у подозреваемых пациентов с COVID-19, обычно манипулируют в лабораториях BSL-2, результаты, представленные в этом исследовании, должны помочь выбрать наиболее подходящий протокол для инактивации, чтобы предотвратить воздействие на персонал лаборатории, отвечающий за прямое и косвенное обнаружение SARS-CoV-2 для диагностических целей.
Последнее редактирование:
